بهینه‌سازی ریزازدیادی گیاه دارویی تجاری استویا (Stevia rebaudiana) از طریق کشت درون شیشه‌ای ریزنمونه رأس شاخه

نوع مقاله: پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نباتات دانشگاه محقق اردبیلی

2 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه محقق اردبیلی

3 استادیار گروه علوم باغبانی دانشگاه محقق اردبیلی

چکیده

سابقه و هدف: استویا (Stevia rebaudiana) شیرین‌ترین گیاه جهان است که به‌عنوان جایگزین مناسب شکر برای درمان مشکلات ناشی از چاقی و دیابت موردتوجه قرار گرفته است ولی بذور آن به‌سختی جوانه زده و بسیاری از آنها به‌دلیل پدیده خودناسازگاری در هنگام شکل‌گیری غالباً پوک و عقیم هستند. همچنین، تکثیر از طرق بذر مانع تولید جمعیت همسان می‌شود. به‌همین دلیل، کشت بافت رهیافت مناسبی برای تکثیر سریع این گیاه می‌باشد. هدف از این پژوهش دست‌ یافتن به روشی سریع و کارامد برای ریزازدیادی گیاه دارویی تجاری استویا و تکثیر انبوه کلون‌های آن در سطح وسیع است.
مواد و روش‌ها: این پژوهش در دو آزمایش جداگانه به اجرا در آمد. در آزمایش اول، ریزنمونه‌های راس شاخه روی محیط کشت MS غنی‌شده با غلظت‌های 5/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم در لیتر برای هر کدام از تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی IAA ، NAA، IBA، BAP، Kin و GA3 به‌عنوان تیمارهای ‌منفرد به‌همراه تیمار شاهد (فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی) کشت شدند. آزمایش بر پایه‌ی طرح کاملاً تصادفی با 4 تکرار انجام گرفت. آزمایش دوم بر اساس نتایج آزمایش اول طراحی گردید. بنابراین، در آزمایش دوم، ریزنمونه‌های راس شاخه روی محیط کشت MS غنی‌شده با BAP (0، 1، 2، 3 و 4 میلی‌گرم در لیتر) و Kin (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) کشت شدند. آزمایش به‌صورت فاکتوریل بر پایه‌ی طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گرفت. در آزمایش ریشه‌زایی، ریز شاخه‌ها در دو محیط کشت MS و MS 1/2 حاوی غلظت‌های مختلف NAA (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) کشت شدند. این آزمایش همانند آزمایش دوم اجرا گردید. در تمامی آزمایشات، صفات 30 روز پس از کشت و نگهداری در اتاقک رشد اندازه‌گیری شدند. در نهایت، گیاهچه‌های ریشه‌دارشده در ابتدا به شرایط اتاقک رشد سازگار شدند و سپس به گلخانه منتقل شدند.
یافته‌ها: در آزمایش اول اثر تنظیم‌کننده‌های رشد بر کلیه صفات معنی‌داری بود (p <0.01)، محیط کشت MS حاوی 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP موثرترین تیمار در بیشترین تعداد شاخه و تعداد میان‌گره (به‌ترتیب با میانگین 75/5 شاخه و 5/19 میانگره در بوته) بود و بیشترین طول شاخه مربوط به 2 میلی‌گرم در لیتر Kin و 5/1 و 2 میلی‌گرم در لیتر GA3 بود و بهترین تیمارهای کالوس‌دهی 5/1 میلی‌گرم در لیتر IBA، 5/1 و 2 میلی‌گرم در لیتر BAP بودند. در آزمایش دوم، برهمکنش BAP ×Kin بر کلیه صفات معنی‌داری بود. بیشترین میزان تکثیر شاخه و تعداد میان‌گره از محیط کشت MS غنی‌شده با 1 میلی‌گرم در لیتر BAP + 5/1 میلی‌گرم در لیتر Kin (به‌ترتیب با میانگین 67/17 شاخه و 67/38 میانگره در بوته) به‌دست آمد. تعداد شاخه‌ها در این تیمار بعد از یک ماه نگهداری مجدد در اتاقک کشت به‌طور قابل‌توجهی از 67/17 به 55 شاخه در بوته افزایش یافت. موثرترین پاسخ ریشه‌زایی به تعداد ریشه (با میانگین 55 ریشه در بوته) در محیط کشت‌ MS 1/2 حاوی 5/1 میلی‌گرم در لیتر NAA مشاهده شد. حدود 92 درصد از گیاهچه‌های رشدیافته در شرایط درون شیشه‌ای به-طور موفقیت‌آمیزی با شرایط گلخانه سازگار شدند.
نتیجه‌گیری: در مجموع نتایج همانند مطالعات قبلی حاکی از واکنش مثبت و خوب گیاه استویا به کشت بافت است. محیط کشت MS غنی-شده با 1 میلی‌گرم در لیتر BAP + 5/1 میلی‌گرم در لیتر Kin برای پرآوری شاخه ریزنمونه رأس شاخه استویا توصیه می‌شود و همچنین نگهداری ریزنمونه‌های کشت‌شده به مدت دو ماه در اتاقک رشد به‌طور چشمگیری تعداد شاخه‌ها را افزایش می‌دهد. در ریشه‌زایی نیز محیط کشت‌ MS 1/2 حاوی 5/1 میلی‌گرم در لیتر NAA نتیجه‌بخش بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of micropropagation for commercial medicinal plant of Stevia (Stevia rebaudiana) through in vitro culture of shoot tip explant

نویسندگان [English]

  • Mahsa Zarei 1
  • Mahdi Behnamian 3
1 Former M. Sc. student of plant breeding, University of Mohaghegh Ardabili
2 Assistant Professor, Department of Agronomy &amp;amp; Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran
3 Assistant Professor, University of Mohaghegh Ardabili
چکیده [English]

Background and objectives: Stevia (Stevia rebaudiana) is the sweetest plant in the world that is considered as suitable alternative to sugar for treating problems of obesity and diabetes, but its seeds are hard to germinate and most of them are often sterile due to incompatibility phenomenon during their formation. Also, it is difficult to produce homogenous population by seed propagation. For this reason, tissue culture is suitable approach for fast multiplication of this plant. The aim of this research was to find a rapid and efficient protocol for micropropagation of commercial medicinal stevia and mass propagation of its clones in large scale.
Materials and methods: This research was conducted in two separate experiments. In the first experiment, the shoot tip explants were cultured on MS media supplemented with 0.5, 1, 1.5 and 2 mg/l concenteratians for each of plant growth regulators include IAA, NAA, IBA, BAP, Kin and GA3 as individual treatments with control treatment (MS medium without plant growth regulators). The experiment was carried out in a completely randomized design with four replications. The second experiment was designed based on the results of the first experiment. So, in the second experiment, the shoot tip explants were cultured on MS media supplemented with BAP (0, 1, 2, 3 and 4 mg/l) and Kin (0, 0.5, 1 and 1.5 mg/l). The tratment was arranged as factorial experiment in a completely randomized design with three replications. In rooting experiment, shootlets were cultured on MS and 1/2 MS medium supplemented with different concentrations of NAA (0, .5, 1 and 1.5 mg/l). This expriment was carried out in the same way as the second expriment. In all experiments, the traits were measured after 30 days of culture and incubation in growth chamber. Finally, the rooted plantlets were initially hardened to culture room conditions and then transferred to greenhouse.
Results: The effect of plant growth regulators was significant for all measurd traits (p < 0.01); MS medium containing 1.5 mg/l BAP was the most efficient treatment for the highest shoot number and internode number (with average of 5.75 shoot and 19.5 internode per plant, respectively) and the longest shoot length related to 2 mg/l Kin and 1.5 & 2 mg/l GA3 and The best treatments for callusing were 1.5 mg/l IBA, 1.5 & 2 mg/l BAP. In the second expriment, the interaction effect of BAP×Kin was significant for all traits. The highest shoot multiplication rate and internode number were obtained from MS medium supplemented with 1 mg/l BAP + 1.5 mg/l Kin (with average of 17.67 shoot and 38.67 internode per plant, respectively). This treatment was incubated in growth chamber for another one month and the shoot number was significantly increased from 17.67 to 55 shoot per plant. Most efficient condition for root production (with average of 55 root per plant) was observed on 1/2 MS medium containing 1.5 mg/l NAA. About 92% of in vitro developed plantlets were successfully established to greenhouse conditions.
Conclusion: general, the results, like previous studies, indicated a positive and good response of the stevia plant to tissue culture. MS medium supplemented with 1 mg/l BAP + 1.5 mg/l Kin was recommended for shoot proliferation of Stevia shoot tip explant and also, incubation of cultured explants in growth chamber for two months was remarkably increased the shoot number. The 1/2 MS medium containing 1.5 mg/l NAA was resultful in root proliferation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Auxin
  • Cytokinin
  • Plant growth regulators
  • Shoot proliferation
  • Rooting
1.Ahmed, R. and Anis, M. 2014. Rapid in vitro propagation system through shoot tip cultures of Vitex trifolia L.–an important multipurpose plant of the Pacific traditional Medicine. Physiol. Mol. Biol. Plants. 20: 3. 385-392.
2.Ali, A., Gull, I., Naz, S. and Afghan, S. 2010. Biochemical investigation during different stages of in vitro propagation of Stevia rebaudiana. Pak. J. Bot. 42: 4. 2827-2837.
3.Asha, K.I., Nair, R.A., Devi, A.I. and Dwivedi, N.K. 2012. In vitro propagation of lesser galangal (Alpinia calcarata Rosc.)-a commercially important medicinal plant through rhizome bud culture. Res. Plant Biol. 2: 5. 13-17.
4.Balaraju, K., Agastian, P., Preetamraj, J.P., Arokiyaraj, S. and Ignacimuthu, S. 2008. Micropropagation of Vitex agnus-castus, (Verbenaceae)-a valuable medicinal plant. In vitro Cell Dev-Pl. 44: 5. 436-441.
5.Chan, P., Xu, D.Y., Liu, J.C., Chen, Y.J., Tomlinson, B., Huang, W.P. and Cheng, J.T. 1998. The effect of stevioside on blood pressure and plasma catecholamines is spontaneously hypertensive rats. Life Sci. 63: 1679-1684.
6.Bennett, L.K. and Davies Jr, F. T. 1986. In vitro propagation of Quercus shumardii seedlings. HortScience. 21: 4. 1045-1047.
7.Dhaka, N. and Kothari, S.L. 2005. Micropropagation of Eclipta alba (L.) Hassk–an important medicinal plant. In vitro Cell Dev-Pl. 41: 5. 658-661.
8.Frederico, A.P., Ruas, P.M., Marin-Morales, M.A., Ruas, C.F. and Nakajima, J.N. 1996. Chromosome studies in some Stevia. Cav. (Compositae) species from Southern Brazil. Braz. J. Genet. 19: 605-609.
9.Gardner, F.P., Pearce, R.B. and Mitchell, R.L. 1985. Physiology of crop plants. 1st ed. Iowa state university Press, Ames, USA, 327p.
10.Goettemoeller, J. and Ching, A. 1999. Seed germination in Stevia rebaudiana. In: J. Janick (ed.), Perspectives on new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA, Pp: 510-511.
11.Guruchandran, V. and Sasikumar, G. 2013. Effect of Polyamines on In vitro Organogenesis using Shoot Tip Explants of Stevia Rebaudiana Bert. Int. J. Rec. Biotechnol. 1: 1. 16-18.
12.Heldt, H.W. and Piechulla, B. 2011. Plant biochemistry. 4th ed. Academic Press, London, UK, 622p.
13.Ibrahim, I.A., Nasr, M.I., Mohammed, B.R. and El-Zefzafi, M.M. 2008. Plant growth regulators affecting in vitro cultivation of Stevia rebaudiana. Sugar Tech. 10: 3. 254-259.
14.Jeppensen, P.B., Gregersen, S., Rolfsen, S.E.D., Alstrup, K.K. and Hermansen, K. 2002. Antihyperglycemic and insulinotropic actions of stevioside in normal and diabetic Goto Kakizaki (GK) rats. Phytomedicine. 9: 9-14.
15.Jitendra, M., Monika, S., Ratan, S.D., Priyanka, G., Priyanka, S. and Kiran, D.J. 2012. Micropropagation of an anti-diabetic plant-Stevia rebaudiana Bertoni, (Natural Sweetener) in Hadoti region of south-east Rajasthan, India. India J. Biol. Sci. 1: 3.37-42.
16.Kartsonas, E. and Papafotiou, M. 2007. Mother plant age and seasonal influence on in vitro propagation of Quercus euboica Pap., an endemic, rare and endangered oak species of Greece. Plant Cell Tiss. Org. 90: 1. 111-116.
17.Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum. 15: 3. 473-497.
18.Luria, G., Weiss, D., Ziv, O. and Borochov, A. 2004. Effect of planting depth and density, leaf removal, cytokinin and gibberellic acid treatments on flowering and rhizome production in Zantedeschia aethiopica. IX International Symposium on Flower Bulbs. Pp: 725-730.
19.Paek, K.Y. and Hahn, E.J. 2000. Cytokinins, auxins and activated charcoal affect organogenesis and anatomical characteristics of shoot-tip cultures of lisianthus [Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn]. In vitro Cell Dev-Pl. 36: 2. 128-132.
20.Purkayastha, J., Sugla, T., Paul, A., Solleti, S. and Sahoo, L. 2008. Rapid in vitro multiplication and plant regeneration from nodal explants of Andrographis paniculata: a valuable medicinal plant.
In vitro Cell Dev-Pl. 44: 5. 442-447.
21.Rafiq, M., Dahot, M.U., Mangrio, S.M., Naqvi, H.A. and Qarshi, I.A. 2007. In vitro clonal propagation and biochemical analysis of field established Stevia rebaudiana Bertoni. Pak. J. Bot. 39: 2467-2474.
22.Rathore, S., Yadav, K., Singh, N. and Singh, S.K. 2014. Comparative study on callus induction, proliferation and plantlets regeneration in two cultivars of Stevia rebaudiana Bertoni-The only non caloric natural sweetener. J. Agr. Sci. 37: 4. 499-508.
23.Rogers, D.S., Beech, J. and Sarma, K.S. 1998. Shoot regeneration and plant acclimatization of the wetland monocot Cattail (Typha latifolia). Plant Cell Rep. 18: 1. 71-75.
24.Sikdar, S.U., Zobayer, N., Azim, F., Ashrafuzzaman, M. and Prodhan, S.H. 2012. An efficient callus initiation and direct regeneration of Stevia rebaudiana. Afr. J. Biotechnol. 11: 45. 10381-10387.
 25.Singh, J. and Tiwari, K.N. 2010. High-frequency in vitro multiplication system for commercial propagation of pharmaceutically important Clitoria ternatea L.-a valuable medicinal plant. Ind. Crops Prod. 32: 3. 534-538.
26.Sivaram, L. and Mukundan, U. 2003. In vitro culture studies on Stevia rebaudiana. In vitro Cell Dev-Pl.
39: 5. 520-523.
27.Skoog, F. and Miller, C.O. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Sym. Soc. Exp. Biol. 54: 118-130.
28.Slavova, Y., Nenkova, D. and Ivanova, I. 2003. Study on the influence of the substance of benzymidazol upon Stevia rebaudiana Bertoni, cultivated in vitro. Bulg. J. Agric. Sci. 9: 2. 225-228.
29.Thakur, R.C. and Karnosky, D.F. 2007. Micropropagation and germplasm conservation of Central Park Splendor Chinese elm (Ulmus parvifolia Jacq. ‘A/Ross Central Park’) trees. Plant Cell Rep. 26: 8. 1171-1177.
30.Thiyagarajan, M. and Venkatachalam, P. 2013. A reproducible and high frequency plant regeneration from mature axillary node explants of Gymnema sylvestre (Gurmur)-An important antidiabetic endangered medicinal plant. Ind. Crop Prod. 50: 517-524.
31.Thiyagarajan, M. and Venkatachalam, P. 2012. Large scale in vitro propagation of Stevia rebaudiana (bert) for commercial application: Pharmaceutically important and antidiabetic medicinal herb. Ind. Crop Prod. 37: 1. 111-117.
32.Thomas, T.D. and Shankar, S. 2009. Multiple shoot induction and callus regeneration in Sarcostemma brevistigma Wight & Arnott, a rare medicinal plant. Plant Biotechnol. Rep. 3: 1. 67-74.
33.Yasukawa, K., Kitanaka, S. and Seo, S. 2002. Inhibitory effect of stevioside on tumor promotion by
12-O-tetradecanoylphorbol- 13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Biol. Pharm. Bull. 25: 1488-1490.
34.Yücesan, B., Büyükgöçmen, R., Mohammed, A., Sameeullah, M., Altuğ, C., Gürel, S. and Gürel, E. 2016. An efficient regeneration system and steviol glycoside analysis of Stevia rebaudiana. In vitro Cell Dev-Pl. 52: 3. 330-337.
35.Zhang, Z. and Finer, J.J. 2016. Use of cytokinin pulse treatments and micrografting to improve sunflower (Helianthus annuus L.) plant recovery from cotyledonary tissues of mature seeds. In vitro Cell Dev-Pl. 52: 4. 391-399.