کلونینگ و توالی یابی ژن p- انسولین جدا شده از گیاه دارویی Momordica charantia و تحلیل بیوانفورماتیکی ساختار سه بعدی پروتئین

نوع مقاله: پژوهشی

نویسندگان

1 هیات علمی دانشگاه

2 عضو هیات علمی

3 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

4 هیات علمی

10.22069/jopp.2020.16363.2486

چکیده

چکیده
سابقه و هدف:
دیابت بیماری است که بدن توانایی کنترل قند خون را از دست می دهد. داروهای شیمیایی تجویز شده به منظور درمان قند خون دارای اثرات جانبی نامطلوب متعددی هستند. در این زمینه داروهای گیاهی جایگزین بسیار مناسبی میباشند چون اثرات جانبی بسیار کم تری دارند. گیاه کارلا با نام علمی Momordica charantia از خانواده Cucurbitaceae می باشد. بذرهای کارلا دارای پلی پپتیدی به نام p-انسولین می باشد که از 172 اسید آمینه تشکیل یافته است. مقدار p-انسولین بسته به بافت گیاه، رقم، محل کشت و فصل برداشت بسیار متغیر است و در مجموع مقدار آن نسبتا پایین میباشد بطوریکه این میزان برای تولید صنعتی داروها بر پایه این ترکیب کافی نیست. علاوه بر این به دلیل وجود ترکیبات مداخله گر مانند پلی ساکارید ها، ممکن است این ماده موثره تاثیر کمتری داشته باشد. کلون کردن ژن p- انسولین و بیان هترولوگ آن در میکروارگانیسم ها، راه حلی سریع و مفید برای حل این مشکل است. بدین منظور در این تحقیق توالی ژن p- انسولین از گیاه کارلا از طریق RT-PCR شناسایی و سپس توالی یابی شد.
مواد و روش ها:
به منظوراستخراج RNA ، در دو مرحله نارس و رسیده از فرابر، آریل بذر و بذر گیاه کارلا نمونه گیری انجام شد. کمیت و کیفیت RNA استخراج شده از طریق دستگاه اسپکتروفوتومتری و الکتروفوز بر روی ژل TBE 1% تعیین شد. سپس جهت کلونینگ ژن p-انسولین، RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن p-انسولین انجام شد. سپس محصول RT-PCR ژن p-انسولین ، از طریق ژل الکتروفورز خالص سازی و کلونینگ ژن p-انسولین در تی وکتور صورت گرفت. پس از استخراج پلاسمید نوترکیب و تایید حضور ژن p-انسولین در تی وکتور، پلاسمید نوترکیب تعیین توالی شد. در ادامه ساختار سه بعدی پروتئین p-انسولین از طریق مدلینگ به کمک نرم افزار Phyre 2.0 (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) بررسی شد.

یافته ها:
در نتایج بدست آمده ازالکتروفورز RNA از بافت های مختلف کارلا، وجود دو باند مربوط به 28SrRNA و 18SrRNA نشان دهنده استخراج موفق RNA بود. نتایج RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن p-انسولین باند اختصاصی bp750 موید تکثیر صحیح cDNA بود. همچنین، بیان ژن p-انسولین در بافت آریل بذر رسیده بیشتر از سایر بافت های میوه بود. پس از خالص سازی باند مربوط به ژن p-انسولین ، واکنش لیگاسیون ژن هدف در داخل تی وکتور و ترانسفورماسیون آن به داخل میزبان E. coli صورت گرفت که نتایج مثبت موید انجام موفق کلونینگ بود. در ادامه تعیین توالی ژن p-انسولین، از گیاه دارویی کارلا برای اولین بار در ایران انجام شد. نتایج بیوانفوماتیک نشان داد که دومین های فعال منواکسیژناز متصل شونده به FDA در بخش N ترمینال و پرولیپوپروتئین دی آسیل گلیسریل ترانسفراز در C ترمینال پروتئین p- انسولین وجود دارد.
نتیجه گیری:
بیان کم پروتئین p- انسولین در گیاه کارلا و وجود ترکیبات مداخله کننده مانند پلی ساکاریدها ممکن است باعث کاهش تاثیر ماده موثره کاهنده قند خون می شود. لذا، در این تحقیق ژن p- انسولین از گیاه کارلا کلون و تعیین توالی شد. تعیین توالی ژن p- انسولین امکان بیان هترولوگ آن در میکروارگانیسم و تولید فراوان و خالص پروتئین p- انسولین را به عنوان دارو فراهم خواهد کرد.
واژه های کلیدی: Momordica charantia، دیابت، کلونینگ، توالی یابی، بیوانفورماتیک

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Cloning and sequencing of p- insulin gene isolated from Momordica charantia and in silico analysis of three dimension of protein structure

نویسندگان [English]

  • Maryam Rahimi 1
  • Majid Azizi 2
  • majid shahbazi 4
1 Zabol University
2 Ferdowsi university of Mashhad
4 Golestan university of Medical Science
چکیده [English]

Abstract:
Background and objectives:
Diabetes is a disease that the body loses its ability to control blood sugar also it is directly associated with an increased risk of cardiovascular disease. Synthetic hypoglycemic drugs can cause serious side effects. Herbal drugs have potential therapeutic applications because they are effective, have fewer side effects and are of relatively low cost. The Momordica charantia (Linn Family: Cucurbitaceae), whose fruit is known as Karela or bittergourd. Karela is one of the famous vegetables of South Asia, India and is grown in the Amazon, East Africa, Islands in the Caribbean and South America to provide food and medicine.
An anti-diabetic agent Polypeptide-P, a 172 amino acid polypeptide isolated from MC seeds. The content of Polypeptide-P in cultivated plants is relatively low and varies widely with tissue, variety, origin and harvest season. Due to impurities such as polysaccharides, the effective ingredient will be less. Gene cloning and expression of this polypeptide in microorganism is a quick and useful alternative for solving such problems. Therefore, in this study the sequence of p-insulin gene from Karela was detected by RT-PCR then sequenced.
Material and method:
RNA was sampled on ripen and unripen fruit from pericarp, seed aril, and seed. Quantification and qualification of extracted RNA was done by spectrophotometer and electrophoreses respectively. Then the RT-PCR reaction was done by p-insulin specific primers and purified by gel electrophoresis and cloned in T-vector plasmid. The recombinant plasmid was extracted and verified to carry p-insulin gene. Then, the recombinant plasmid was done to sequence the p-insulin gene. The 3D structure of p-insulin protein was evaluated by Phyre 2.0 (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) software.

Results:
The electrophoresis of extracted RNA from Karela tissues showed the two 18SrRNA and 28SrRNA bands. A 750 base pair RT-PCR product was amplified by p-insulin specific primers. Also, the RT-PCR result depicted that the p-insulin gene was expressed in aril tissue more than other parts of the fruit. The result showed that the cloning process of p-insulin gene consist of purification of p-insulin PCR production, the ligation reaction and transformation of it’s into the E. coli was successful. Then, the Karela isolated p-insulin gene was sequenced for the first time in Iran. Blasting the plant insulin protein sequence in uniprot database (www.uniprot.org) detected the most important candidate domains including FDA-binding monooxygenase at the N terminal and Prolipoproteindiacyl glyceryltransferase at C terminal of protein.
Conclusion:
The low expression of p-insulin and the presence of polysaccharide impurities in Karela reduces the effect of a blood glucose-lowering agent. Therefore, in this study, p-insulin gene of Karela was isolated and sequenced. The sequencing of p-insulin gene will allow its heterologous expression in microorganisms and pure production of p-insulin protein.
Key words: Momordica charantia, Diabetes, Cloning, Sequencing, Bioinformatics

کلیدواژه‌ها [English]

  • Momordica charantia
  • Diabetes
  • Cloning
  • Sequencing
  • Bioinformatic