ارزیابی تنوع ژنتیکی پرتقال Citrus sinensis با استفاده از نشانگر ISSR و رتروترانسپوزون

نوع مقاله : مقاله کامل علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی‌ارشد گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 نویسنده مسئول، استاد گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

3 استادیار گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

10.22069/jopp.2021.19141.2828

چکیده

سابقه و هدف: مشخص شدن رده بندی، روابط فیلوژنتیک و تنوع ژنتیکی در مرکبات جهت تعیین روابط ژنتیکی، شناسایی ژرم پلاسم، کنترل فرسایش ژنتیکی، ایجاد برنامه های اصلاحی و ثبت ارقام جدید، امری مهم و حیاتی است. محققین معتقدند که تنوع ژنتیکی از اهمیت بسیار بالایی برخوردار بوده و جز اساسی هر برنامه اصلاحی است. استفاده از تکنیک های مولکولی برای ارزیابی در سطح DNA، تنوع ژنتیکی و فاصله ژنتیکی در نمونه های ژرم پلاسم به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می‌گیرد. بنابراین هدف از این پژوهش بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های پرتقال به کمک نشانگرهای مولکولی است.
مواد و روش‌ها: این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 40 ژنوتیپ پرتقال شهرستان رودسر در استان گیلان مورد ارزیابی گرفت. استخراج DNA از نمونه‌های برگی جوان با استفاده از روش ادوارد با اندکی تغییر انجام شد. پس از استخراج DNA ژنوتیپ‌ها، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با 15 آغازگر صورت گرفت. تصاویر DNA ژنومی تکثیر شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و داده‌ها به صورت یک ماتریس وارد نرم‌افزار اکسل شد. محتوای اطلاعات چندشکلی، شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر، تعداد آلل مؤثر، شاخص شانون و تنوع ژنی نی نیز بررسی شدند.
یافته‌ها: پانزده آغازگر مورد استفاده در این مطالعه توانستند در مجموع 140 باند ایجاد کنند که از این تعداد 101 باند چند شکل بودند که از این بین آغازگرهای TOS-1 و TOS-2 با 9 نوار بیشترین و آغازگر UBC811 و آغازگر ترکیبی UBC8821+UBC826 با 4 نوار کمترین تعداد نوار چند شکل را ایجاد کردند. آغازگرهای TOS-1، UBC813، UBC823 و TOS-2 و UBC811 به ترتیب با داشتن بالاترین مقدار PIC، بهترین شاخص‌های نشانگری و مقادیر بالای تعداد آلل مؤثر، شاخص شانون، تنوع ژنی نی به عنوان آغازگرهای برتر جهت بررسی تنوع ژنتیکی در این پژوهش معرفی شدند. بر اساس نتایج بدست آمده نشانگرهای مورد استفاده توانستند تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌ها را به خوبی ارزیابی کنند. محتوای اطلاعات چند شکل در این تحقیق بین 22/0 تا 45/0 متغیر بود. تجزیه به مختصات اصلی نشان داد که سه مولفه اول توانستند در مجموع 08/29 درصد از واریانس کل را توجیه کنند. تجزیه خوشه‌ای به روش دورترین همسایه 40 ژنوتیپ پرتقال را بر اساس تشابه و تفاوت در پنج گروه مجزا قرار داد. صحت گروه‌بندی حاصل از تجزیه‌ خوشه‌ای توسط تابع تشخیص کانونی به روش خطی فیشر 100 درصد تأیید شد. نشانگرهای به کار رفته در این پژوهش چندشکلی قابل قبولی را نشان دادند. بررسی صفات ریخت‌شناسی و نشانگرهای مولکولی استفاده شده در این پژوهش درجه قرابت و تفاوت ژنوتیپ‌ها را به خوبی نشان داد هرچند که تفاوت‌هایی در نتایج بدست آمده از بررسی‌های ریخت‌شناسی و مولکولی مشاهده شد که می‌تواند ناشی از بالا بودن دقت نشانگرهای مولکولی باشد. به‌طور کلی در این پژوهش استفاده از صفات ظاهری و مورفولوژی امکان تفکیک ژنوتیپ‌های پرتقال از یکدیگر به خوبی محیا شد.
نتیجه‌گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که تنوع ژنتیکی بالایی در بین ژنوتیپ‌های پرتقال وجود دارد. با توجه به اینکه نشانگرهای به کار رفته در این پژوهش چندشکلی قابل قبولی را نشان دادند می‌توان در تحقیقات آینده روی این گیاه و سایر گیاهان تیره مرکبات از آن‌ها استفاده کرد. به طور کلی با توجه به نتایج این پژوهش آغازگرهای ISSR و رتروترانسپوزون می‌توانند به عنوان یک روش مولکولی ساده مبتنی بر PCR و نسبتا مطمئن و قابل اعتماد در تعیین سطح تنوع ژنتیکی و روابط فیلوژنتیک در مرکبات به کار روند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Assessment of genetic diversity in Citrus sinensis by ISSR marker and retrotransposon

نویسندگان [English]

  • Abbas Rajabi 1
  • Habibollah Samizadeh Lahiji 2
  • Mohammad Mohsenzadeh Golfazani 3
1 .Sc. Student, Dept. of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Corresponding Author, Professor, Dept. of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
3 Assistant Prof., Dept. of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran.
چکیده [English]

Background and objectives: Determining the classification, phylogenetic relationships, and genetic diversity in citrus is critical to determining genetic relationships, identifying germplasm, controlling genetic erosion, establishing breeding programs, and registering new cultivars. Researchers believe that genetic diversity is very important and is an essential part of any breeding program. The use of molecular techniques to assess DNA level, genetic diversity, and genetic distance is widely used in germplasm samples. Therefore, the aim of this study was to investigate the genetic diversity of orange genotypes using molecular markers.
Materials and methods: In order to investigate the genetic diversity, 40 orange genotypes of Rudsar city in Guilan province were evaluated. DNA extraction from young leaf samples was performed using the Edward method with slight modifications. After DNA extraction of genotypes, polymerase chain reaction (PCR) was performed with 15 primers. Amplified genomic DNA images were analyzed and the data were entered into Excel software as a matrix. Polymorphic information content, marker index, effective multiple ratio, number of effective alleles, Shannon index and straw gene diversity were also examined.
Results: The 15 primers used in this study were able to create a total of 140 bands, of which 101 were polymorphic bands, including TOS-1 and TOS-2 primers with 9 bands, UBC811 primer and UBC8821 + UBC826 hybrid primer with 4 Tape created the least number of polymorphic strips. Primers TOS-1, UBC813, UBC823 and TOS-2 and UBC811 with the highest PIC value, best markers and high values of effective allele, Shannon index, straw gene diversity as the top primers to study genetic diversity in this study, respectively were. Based on the results, the markers used were able to evaluate the genetic diversity of genotypes. The content of polymorphic information in this study ranged from 0.22 to 0.45. Principal coordinate analysis showed that the first three components were able to explain a total of 29.08% of the total variance. Cluster analysis by the farthest neighbor method divided 40 orange genotypes into five distinct groups based on similarities and differences. The grouping accuracy obtained from the cluster analysis was confirmed by the Fisher linear focal detection function 100%. The markers used in this study showed acceptable polymorphism. Also, the study of morphological traits and molecular markers used in this study showed the degree of similarity and differences of genotypes, although there were differences in the results of morphological and molecular studies that can be observed. Due to the high accuracy of molecular markers. However, using appearance and morphology, it was possible to distinguish orange genotypes from each other.
Conclusion: The results of this study showed that there is a high genetic diversity among orange genotypes. Due to the fact that the markers used in this study showed acceptable polymorphism, they can be used in future research on this plant and other citrus plants. In general, according to the results of this study, that ISSR and retrotransposon primers can be used as a simple molecular method based on PCR and relatively safe and reliable in determining the level of genetic diversity and phylogenetic relationships in citrus.

کلیدواژه‌ها [English]

  • PIC
  • analysis detection function
  • Cluster analysis
  • simple maching coefficient
1.Talon, M. and Gmitter, F.G. 2008. Citrus genomics. Int. J. Plant Genomics 2008.
2.Liu, Y., Heying, E. and Tanumihardjo, S. A. 2012. History, global distribution, and nutritional importance of citrus fruits. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf.11: 6. 530-545.
3.Golein, B. and Adoli, B. 2012.Citrus (planting). Pouya Novin Publ. 162p. (In Farsi)
4.Atiyah, A. 2016. Molecular Characterization and Genetic Diversity Analysis of Sweet Orange (Citrus sinensis L. Osbeck) Cultivars in Iraq Using RAPD Markers. Eur. J. Mol. Biotechnol. 1: 4-12.
5.Krueger, R.R. and Roose, M.L. 2003. Use of molecular markers in the management of citrus germplasm resources. J. Am. Soc. Hort. Sci. 128: 6. 827-837.
6.Verma, S., Karihaloo, J. L., Tiwari, S. K., Magotra, R. and Koul, A.K. 2007. Genetic diversity in Eremostachys superba Royle ex Benth. (Lamiaceae), an endangered Himalayan species, as assessed by RAPD. Genet. Resour. Crop Evol. 54: 2. 221-229.
7.Yang, S., Guo, N. and Ge, H. 2016. Morphological and AFLP-based genetic diversity in Rosa platyacantha population in eastern Tianshan mountains of northwestern China. Hort. Plant J.2: 1. 55-60.
8.Barkley, N.A., Roose, M.L., Krueger, R.R. and Federici, C.T. 2006. Assessing genetic diversity and population structure in a citrus germplasm collection utilizing simple sequence repeat markers (SSRs). Theor. Appl. Genet. 112: 8. 1519-1531.
9.Haidari, P., Mehrabi, A.A. and Nasrollah, N.G.A.A. 2017. Genetic diversity of Balm (Melissa officinalis L.) landraces and genetic relationship within and between them using ITS markers. J. Med. Plants and By-prod. 1: 97-104.
10.Basha, A.I., Padulosi, S., Chabane, K., Hadj-Hassan, A., Dulloo, E., Pagnotta, M.A. and Porceddu, E. 2007. Genetic diversity of Syrian pistachio (Pistacia vera L.) varieties evaluated by AFLP markers. Genet. Resour. Crop Evol.54: 8. 1807-1816.
11.Zane, L., Bargelloni, L. and Patarnello, T. 2002. Strategies for microsatellite isolation: a review. Mol. Ecol. 11: 1. 1-16.
12.Reddy, M.P., Sarla, N. and Siddiq, E. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 128: 1. 9-17.
13.Shahsavar, A., Izadpanah, K., Tafazoli, E. and Tabatabaei, B.S. 2007. Characterization of citrus germplasm including unknown variants by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Sci. Hort. 112: 3. 310-314.
14.El-Mouei, R., Choumane, W. and Dway, F. 2011. Characterization and estimation of genetic diversity in Citrus rootstocks. Int. J. Agric. Biol. 13: 4.
15.Abedinpour, H., Ranjbar, G.A., Jelodar, N. and Golein, B. 2014. Evaluation of genetic diversity in Citrus genotypes by IRAP molecular marker. Intl. J. Farm & Alli Sci. 3: 230-234.1. (In Farsi)
16.Wicker, T., Sabot, F., Hua-Van, A., Bennetzen, J.L., Capy, P., Chalhoub, B. and Panaud, O. 2007. A unified classification system for eukaryotic transposable elements. Nat. Rev. Genet. 8: 12. 973-982.
17.Biswas, M.K., Baig, M., Cheng, Y.J. and Deng, X.X. 2010a. Retro-transposon based genetic similarity within the genus Citrus and its relatives. Genet. Resour. Crop Evol. 57: 963-972
18.Edwards, K., Johnstone, C. and Thompson, C. 1991. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19: 6. 1349.
19.Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S. and Rafalski, A. 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breed. 2: 3. 225-238.
20.Nei, M. 1972. Genetic distance between populations. Am. Nat. 106: 949. 283-292.
21.Abouzari, A., Dadras, A.R., Golein, B. and Tajvar, Y. 2021. Investigation of genetic diversity and structure analysis of different Citrus genotypes usingISSR markers. Plant Genet  Researches. 7: 2. 13-24. (In Farsi)
22.Babakhani, B., Naghashi, Y., Hosseini, B.S. and Hoshi, M. 2020. The genetic diversity of some citrus varieties using microsatellite molecular markers. J. Plant Ecophysiol. 49: 271-280. (In Farsi)
23.Sharafi, A.A., Sharafi, A. and Abkenar, A.A. 2017. Molecular genetic diversity assessment of Citrus species grown in Iran revealed by SSR, ISSR and CAPS molecular markers. Int. J. Sci. Res.8: 22-27.
24.Sülü, G., Kacar, Y.I.L.D.I.Z., Polat, İ., KİTAPCI, A., Turgutoğlu, E., Şimşek, Ö.Z.H.A.N. and Satar, G. 2020. Identification of genetic diversity among mutant lemon and mandarin varieties using different molecular markers.Turk. J. Agric. For. 44: 5. 465-478.
25.Yu, H., Yang, X., Guo, F., Jiang, X., Deng, X. and Xu, Q. 2017. Genetic diversity and population structure of pummelo (Citrus maxima) germplasm in China. Tree Genet. Genomes. 13: 3. 58.
26.Pal, D., Malik, S.K., Kumar, S., Choudhary, R., Sharma, K.C. and Chaudhury, R. 2013. Genetic variability and relationship studies of mandarin (Citrus reticulata Blanco) using morphological and molecular markers. Agric. Res. 2: 3. 236-245.
27.Lombardo, G., Schicchi, R., Marino, P. and Palla, F. 2012. Genetic analysis of Citrus aurantium L. (Rutaceae) cultivars by ISSR molecular markers. Plant Biosyst., Symp. Int. Organ. Plant Biosyst. 146 (sup1), 19-26.
28.Raheb, S., Ghasemnezhad, M., Golain, B., Golmohammadi, M. and Sabori, A. 2019. Investigation of polymorphism in different acid lime (Citrus aurantifolia Swingle) genotypes with free witches broom disease by molecular markers of SSR and ISSR. Iran. J. Hort. Sci.50: 1. 1-11. (In Farsi)
29.Khayam Nekouei, M., Jahantighi, R., Solouki, M., Mohammadi, R. and Emamjomeh, A. 2009. Study on genetic diversity of tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.) genotypes using AFLP marker. J. Agric. Sci. Nat. Resour. 16p.
30.Mohsenzadeh Golfzaei, M., Samizadeh Lahiji, H., Aalami, A., Shoaei Deilami, M. and Talesh Sasani. S. 2012. Investigation of genetic diversity of different greenhouse tobacco genotypes using ISSR and retrotransposon markers. Iran. J. Field Crop Sci. 43: 2. 371-380. (In Farsi)
31.Khiavi, S.J., Hamidoghli, Y., Golein, B. and Sabouri, A. 2016. Assessment of lime genetic diversity in three regions of Iran using morphological and ISSR markers. Agric. Sci. Commun. 4: 18-29.
32.Tripolitsiotis, C., Nikoloudakis, N., Linos, A. and Hagidimitriou, M. 2013. Molecular characterization and analysis of the
greek citrus germplasm. Not. Bot. Horti Agrobot. Cluj-Napoca. 41: 2. 463-471.
33.Biswas, M.K., Xu, Q. and Deng, X.X. 2010b. Utility of RAPD, ISSR, IRAP and REMAP markers for the genetic analysis of Citrus spp. Sci. Hort.124: 2. 254-261.
34.Gulsen, O. and Roose, M. 2001. Chloroplast and nuclear genome analysis of the parentage of lemons. J. Am. Soc. Hort. Sci. 126: 2. 210-215.